Llamamos secuenciación de ADN al conjunto de técnicas y
metodologías que nos permiten determinar la estructura primaria de este
material genético. Es decir, que nos permiten conocer el orden en el que los
distintos nucleótidos (adenina, timina, citosina y guanina) se disponen en un
fragmento de ADN.
Los primeros métodos de secuenciación de ADN fueron
desarrollados en los años 70 del siglo XX por los científicos Allan Maxam y
Walter Gilbert, y consistían, básicamente, en la modificación química del ADN y
una posterior rotura para liberar pequeños fragmentos que eran separados
electroforéticamente (aprovechando la diferente movilidad de fragmentos de
distinta masa al atravesar un campo eléctrico a través de una matriz porosa) en
un gel.
Pero muy poco después, Frederick Sanger (único científico
que ha obtenido en dos ocasiones el Premio Nobel en Química) desarrolló un
método de secuenciación de ADN mucho más sencillo, rápido, eficiente, escalable
y reproducible que el método químico de Maxam y Gilbert, conocido como método
de terminación de cadena. En éste se lleva a cabo una pcr (reacción en cadena
de la polimerasa) en la que se utilizan ddNTPs (didesoxinucleótidos trifosfato),
que van a actuar como terminadores de la reacción. Estos ddNTPs se encuentran
en el medio de reacción en una proporción determinada con respecto a los dNTPs,
que son los monómeros que al unirse dan lugar a una cadena de ADN. La única
diferencia entre un ddNTP y un dNTP es la ausencia en el primero de un grupo
químico llamado hidroxilo y que es fundamental en la polimerización del ADN. Y
es tan importante este grupo que si la enzima encargada de llevar a cabo la
síntesis del ADN se encuentra con un ddNTP en lugar de con un dNTP va a dejar
de “trabajar” y la cadena se va a quedar sin concluir.
Así, si partimos de un fragmento de cien nucleótidos y llevamos a cabo una pcr en la que tengamos tanto dNTPs como ddNTPs, lo que vamos a obtener como productos finales serán cien fragmentos que se van a diferenciar entre sí en un solo nucleótido. Tendremos un fragmento de un nucleótido, otro de dos nucleótidos, otro de tres, etc. Adicionalmente, cada uno de estos fragmentos se habrá marcado con una molécula química (fluoróforo) que al ser radiada con la luz de un láser va a emitir un color determinado en función del último nucleótido añadido. Es decir, todos los fragmentos en los que se haya añadido una adenina como terminador de la reacción emitirán fluorescencia a una longitud de onda determinada; todos los que terminen con una timina, lo harán a otra longitud de onda. Y lo mismo con la citosina y la guanina. Por último, todas estas señales lumínicas son captadas por una cámara, de manera que un software es capaz de integrarlas para ofrecernos la secuencia de nucleótidos del ADN de partida.
Así, si partimos de un fragmento de cien nucleótidos y llevamos a cabo una pcr en la que tengamos tanto dNTPs como ddNTPs, lo que vamos a obtener como productos finales serán cien fragmentos que se van a diferenciar entre sí en un solo nucleótido. Tendremos un fragmento de un nucleótido, otro de dos nucleótidos, otro de tres, etc. Adicionalmente, cada uno de estos fragmentos se habrá marcado con una molécula química (fluoróforo) que al ser radiada con la luz de un láser va a emitir un color determinado en función del último nucleótido añadido. Es decir, todos los fragmentos en los que se haya añadido una adenina como terminador de la reacción emitirán fluorescencia a una longitud de onda determinada; todos los que terminen con una timina, lo harán a otra longitud de onda. Y lo mismo con la citosina y la guanina. Por último, todas estas señales lumínicas son captadas por una cámara, de manera que un software es capaz de integrarlas para ofrecernos la secuencia de nucleótidos del ADN de partida.
